概述

          單核-巨噬系統（Mononuclear Phagocyte System，MPS），是由一組具(jù)有(yǒu)共同起源、形态和功能(néng)的細胞組成的系統。這些細胞主要負責吞噬和消化體(tǐ)内的病原體(tǐ)、死細胞和異物(wù)，參與免疫防禦和組織修複。近年來，随着對單核巨噬細胞的深入研究，發現巨噬細胞與多(duō)種疾病有(yǒu)關，包括代謝(xiè)、自身免疫、癌症等疾病均具(jù)有(yǒu)重要調控作(zuò)用(yòng)，因此，針對單核巨噬細胞的靶向遞送對于相關領域的藥物(wù)開發、疾病機制研究至關重要。mRNA in vitro，幫助單核巨噬細胞研究進入新(xīn)的周期，實現敲低和過表達，為(wèi)單核巨噬細胞靶點驗證提供保障。為(wèi)解決更多(duō)單核巨噬細胞靶點的體(tǐ)内概念驗證和成藥研究，多(duō)納醫(yī)藥基于自有(yǒu)知識産(chǎn)權的核酸遞送技(jì )術，開發了用(yòng)于體(tǐ)内單核巨噬細胞遞送的CALNP™ MPS-LNP制劑服務(wù)，為(wèi)更多(duō)單核巨噬細胞研究的體(tǐ)内驗證提供支持和保障。

研發流程

1、靶點調研

2、體(tǐ)外序列篩選

3、最優序列合成

4、CALNP™ MPS-LNP制備

5、動物(wù)模型驗證

已驗證數據

1、CALNP™ MPS-LNP制劑理(lǐ)化性質(zhì)

2、體(tǐ)外巨噬細胞CALNP™ MPS-LNP轉染效率研究

選用(yòng)RAW264.7、J774和MH-S三種小(xiǎo)鼠巨噬細胞計數種闆，貼壁培養過夜，換液加入含有(yǒu)不同濃度的CALNP™ MPS-LNP（包裹X-siRNA，X為(wèi)巨噬細胞特異性表達蛋白）轉染24 h後檢測細胞X-mRNA水平，結果顯示高、低濃度CALNP™ MPS-LNP孵育均可(kě)顯著敲低三種巨噬細胞敲低X-mRNA水平，其中(zhōng)高濃度組減少約80% mRNA表達。

圖1. 三種巨噬細胞體(tǐ)外孵育CALNP™ MPS-LNP敲低巨噬細胞相關基因mRNA水平。

3、體(tǐ)内系統給藥遞送CALNP™ MPS-LNP制劑——連續兩次給藥（PK-PD研究）

C57BL/6J小(xiǎo)鼠腋下接種5×10⁵個CT26細胞，待腫瘤體(tǐ)積增長(cháng)至300~500 mm³，給予小(xiǎo)鼠包載Cy5-siRNA的CALNP™ MP-LNP制劑，隔天給藥一次，劑量為(wèi)1 mg/kg。兩次給藥後，在6小(xiǎo)時、24小(xiǎo)時和48小(xiǎo)時的時間點對小(xiǎo)鼠離體(tǐ)髒器進行熒光強度測定，發現除心髒以外，其他(tā)髒器在注射後的6小(xiǎo)時均顯示出強烈的Cy5熒光信号，并在此時達到最高值。特别地，在肝髒、脾髒和腫瘤組織中(zhōng)，Cy5熒光信号的持續時間較長(cháng)，至24小(xiǎo)時甚至48小(xiǎo)時後仍可(kě)檢測到。

圖2. CT26荷瘤小(xiǎo)鼠連續兩次給予Cy5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP後不同時間點離體(tǐ)髒器熒光強度。

對熒光分(fēn)布較多(duō)的肝、脾和腫瘤組織，進行消化後，測定不同時間點CD11b+/CD45+細胞内Cy5熒光強度與F4/80的關系。可(kě)見Cy5陽性細胞主要為(wèi)F4/80陽性的巨噬細胞，在肝和脾中(zhōng)分(fēn)别于1h和6h有(yǒu)最大Cy5陽性細胞比例，對于腫瘤，在6h、24h和48h均有(yǒu)明顯Cy5陽性巨噬細胞的積累。與離體(tǐ)組織熒光成像結果一緻。

圖3. CT26荷瘤小(xiǎo)鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP後不同時間點腫瘤組織内巨噬細胞Cy5熒光強度變化。

圖5. CT26荷瘤小(xiǎo)鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP後不同時間點脾髒組織内巨噬細胞Cy5熒光強度變化。

離體(tǐ)組織裂解後進行RNA提取和RT-qPCR檢測，結果顯示脾髒、肝髒和腫瘤組織中(zhōng)給藥後6 h和24 h可(kě)敲低目标基因50%~80%，其中(zhōng)6 h敲低效果最明顯。

圖6. CT26荷瘤小(xiǎo)鼠連續兩次給予Cy 5-siRNA-CALNP™ MPS-LNP後不同時間點各髒器組織内敲低基因mRNA水平變化。

 4、體(tǐ)内系統給藥遞送CALNP™ MPS-LNP制劑——連續多(duō)次給藥（Efficacy研究）

C57BL/6J小(xiǎo)鼠腋下接種5×10⁵個CT26細胞，待腫瘤體(tǐ)積增長(cháng)至~150 mm³，給予小(xiǎo)鼠包載X-siRNA的CALNP™ MP-LNP制劑，隔天給藥一次，劑量為(wèi)1 mg/kg。從腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)可(kě)見，從第四次給藥開始，給與siRNA藥物(wù)組相比較與對照組腫瘤生長(cháng)顯著被抑制并持續到末次給藥，兩組動物(wù)體(tǐ)重均正常增加，實驗給藥過程中(zhōng)無動物(wù)死亡。

圖7.MC38荷瘤小(xiǎo)鼠多(duō)次給予siRNA-CALNP™ MPS-LNP（治療性）後腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)和體(tǐ)重增長(cháng)曲線(xiàn)。

實驗終點分(fēn)離髒器組織進行消化提取RNA後采用(yòng)RT-qPCR方法檢測不同髒期内目标敲低基因mRNA表達水平，結果顯示脾髒、肝髒和腫瘤組織中(zhōng)給藥組相較于對照組目标基因敲低明顯，其中(zhōng)脾髒表達抑制最多(duō)，約65%；肝髒和腫瘤組織中(zhōng)RNA表達抑制約為(wèi)30%。

圖8. MC38荷瘤小(xiǎo)鼠多(duō)次給予siRNA-CALNP™ MPS-LNP（治療性）後終點不同組織敲除基因mRNA水平測定。

同時，在實驗終點也收集了動物(wù)血漿進行血生化和血細胞計數分(fēn)析，結果顯示兩組間各個指标均無顯著差異，結合給藥期間動物(wù)體(tǐ)重的正常增加顯示siRNA-CALNP™ MPS-LNP制劑安(ān)全性良好，動物(wù)均可(kě)耐受。